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Full moon芯片常见问题

1. Q:蛋白芯片和蛋白质芯片两者有什么区别?

A:蛋白芯片包括抗体芯片和蛋白质芯片两个大类。抗体芯片是由多个抗体形成的微阵列,可以区分混合样本中多种不同蛋白质的表达丰度或者修饰比例,是进行特定多个蛋白质表达和磷酸化筛选的首先技术。
蛋白质芯片是由多种纯化的全长蛋白质形成的微阵列,其检测原理主要是基于芯片上蛋白质的结构特性和蛋白互作的生物活性。一般在筛选某种特定的蛋白质、核酸、小分子药物或糖脂等分子所结合的它种蛋白质时,蛋白质芯片尤为适用,成为pull-down加质谱实验体系的很好补充和替代技术。同时,研究人员还可以用蛋白芯片筛选自身免疫病或者肿瘤病人血清的自身抗体,以作标志物之用。另外,还可以在芯片上进行酶与底物反应实验,从而确定修饰酶的底物谱。总之,蛋白芯片技术衍生的产品已经非常丰富,可以解决的科学问题也非常多,是未来蛋白研究领域的常规技术。

2. Q: 蛋白芯片和质谱技术,哪种技术比较好?客户该如何选择?

A:质谱技术与蛋白芯片技术是蛋白组学研究领域中两种最主要的技术类型,两种技术各有优点。质谱技术的应用方向更偏组学性质,可检测的蛋白类型和数量比较广泛,并且通过质谱技术可以发现新的蛋白质或蛋白修饰形式,或者是检测人、大鼠、小鼠等常用模式生物之外其他物种的蛋白变化(如细菌、植物等)技术。
蛋白芯片技术是高通量技术与分子生物学技术结合的产物,其应用方向更偏向于大批特定检测目标的筛选,筛选精度较质谱更高。由于蛋白芯片在设计时就已经根据蛋白的功能属性进行了归类,检测指标的背景资料也更为丰富。因此,在数据解析难度上蛋白芯片较质谱、测序等其他组学技术要低很多。较质谱而言,蛋白芯片与Western和ELISA等方法在检测原理上更为接近,用Western等方法对蛋白芯片数据的验证效率较质谱更高。

3. Q:蛋白芯片可以应用于哪些研究领域?

A:蛋白芯片主要分为抗体芯片和蛋白质芯片两大类,前者是不同的抗体形成的微阵列,可以用来高通量相对定量或绝对定量检测某一类型的蛋白质,是疾病的发生、发展的机制研究以及疾病标志物筛选等研究的有力工具;蛋白质芯片是不同种类的蛋白质形成的微阵列,是功能性芯片的代表。可以进行疾病诊断标志物、抗体特异性、药物靶点等筛选研究,以及蛋白质与蛋白质、核酸、小分子药物、糖类、脂类等的相互作用检测。同时,还可以在此类芯片上进行复杂的酶与底物反应实验,从而确定酶的底物谱,进而广泛用于磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等蛋白修饰研究。

4. Q:蛋白芯片的灵敏度、重复性、动态检测范围怎样?

A:蛋白芯片基本采用荧光检测,其灵敏度要比ELISA(比色法)、Western(化学发光法)更加灵敏和稳定。片内和片间的技术重复相关系数R2均可以达到0.9以上。定量检测其检测范围与标准品的线性范围有关,检测灵敏度可达到 pg/mL级别。

5. Q:蛋白芯片结果准确吗?

A:相比质谱技术,蛋白芯片原理就是抗原抗体反应的高通量化,与经典的Western和ELISA从技术原理上具有更强的可比性。蛋白芯片上设置有多种技术重复和质控参照点,有效保证芯片数据的可靠性。另外,蛋白芯片还具有检测指标功能集中化的特点,在数据分析的时候,得到的结果不再是某个蛋白差异变化的孤立数据,还可获得同类蛋白变化的完整证据链,比如信号通路上下游协同调变的数据。

6. Q:蛋白芯片可以给出定量结果吗?

A:蛋白芯片可以给出定量结果。一般情况研究目的仅为比较对照样本间某些指标的差异,通过差异反应和解释生物现象则只需要进行半定量检测。一般检测生物流体里的蛋白质,尤其是分泌蛋白,需要进行绝对定量检测,进行绝对定量检测方便后续临床应用的转化过程,以及与现有文献进行对比。

7. Q:信号通路抗体芯片是怎么检测信号通路的?

A:信号通路抗体芯片/蛋白芯片针对每一条信号通路,如p53:从细胞膜到胞浆到核内,参与整条信号通路的蛋白质均设置抗体进行检测,针对某些蛋白会有多个磷酸化位点的情况,我们也会设置多个磷酸化位点的特异抗体进行检测。将这些抗体固相结合到一张芯片片基上,以实现对于一个样本中整条p53通路的检测。同时,我们还设计有广谱筛选抗体芯片/蛋白芯片,将多条信号通路中的相关蛋白特异抗体固相结合到芯片片基上,从而实现对信号通路蛋白的广谱筛选。

8. Q:在磷酸化抗体芯片中,为什么往往一个蛋白会有多个抗体对应?

A:由于一个蛋白质往往具有不同的磷酸化位点,这些位点的不同磷酸化水平又对应不同的功能状态。而我们抗体芯片/蛋白芯片上的抗体是特异针对每个磷酸化位点的,因此一个蛋白由于具有多个磷酸化位点往往会有多个抗体对应。例如 c-Jun(Phospho-Thr91) 只检测 c-Jun 的Threonine 91 的磷酸化状态,而 c-Jun(Phospho-Tyr170) 只检测 c-Jun 的 Tyrosine 170 的磷酸化状态。

9. Q:蛋白芯片抗体列表中经常会有这样的情况 p53(ab-15) 或者 p53(phospho-Ser15) ,应该怎样理解?

A:括号中的数字说明这是该蛋白的磷酸化位点位置。 p53(Ab-15) 和 p53(phospho-Ser15) 的区别是:抗体 p53(Ab-15) 是使用围绕 p53 Serine 15 位点周围的一段合成的多肽制备的,其中 Serine 15 为非磷酸化状态;而抗体 p53(phospho-Ser15) 也是使用围绕 p53 Serine 15 周围的一段合成的多肽制备的,而其中 Serine 15 位点为磷酸化状态。因此抗体 p53(Ab-15) 只能识别非磷酸化状态 Serine 15 ,而抗体 p53(phospho-Ser15) 可以识别磷酸化状态 Serine 15,这两个抗体在蛋白芯片上是配对的.

10. Q:蛋白芯片实验,样本裂解需要加入蛋白酶抑制剂吗?

A:抗体芯片/蛋白芯片的配套裂解试剂中是不含蛋白酶抑制剂的。样本取来后,会在低温快速的情况下完成蛋白质提取、标记以及杂交过程。如果您需要自己裂解样本,那么推荐您在蛋白质裂解过程中加入蛋白酶抑制剂。

11. Q:可以使用除了抗体芯片配套试剂盒中的提取缓冲液以外的蛋白裂解试剂吗?

A:是的,在抗体芯片/蛋白芯片实验中,细胞或者组织裂解获得蛋白质的过程中是可以使用各种缓冲液的(如:RIPA裂解液),但是这些缓冲液不能包含 Tris 。因为 Tris 组分会影响到下一步的蛋白质标记步骤。因此,在使用含有 Tris 组分的缓冲液获得蛋白质之后,推荐使用 Millipore, Microcon YM-10 filters (Catalog: 42406) 或者 Sephadex G-25 columns 置换成标记缓冲液体系。

12. Q: 蛋白芯片实验使用细胞样本,获得100 ug总蛋白需要多少细胞?

A:由于细胞类型不同,每个细胞的蛋白含量也不尽相同。我们通常蛋白芯片实验中使用 10^6 - 10^7 的细胞可提取大约 1 mg蛋白质,其中大约 100ug 用来进行标记与杂交,因此我们推荐提供 5X10^6 细胞用于抗体芯片检测。

13. Q: 相对于传统的WB、ELISA,蛋白芯片有哪些优势?

A:蛋白芯片采用荧光标记进行检测,而WB采用化学发光、ELISA采用比色法进行检测,无论检测灵敏度还是信号稳定性,荧光标记都更胜一筹,这也是生物领域中大量检测设备采用荧光法的原因。相对于WB和ELISA,采用抗体芯片/蛋白芯片的方式进行相关细胞因子的检测,检测范围和灵敏度外更高。高通量是蛋白芯片最大的优势,不仅经济省时,还使得检测数据更加具有横向可比性。

14. Q: 药物机理研究,应该先检测蛋白差异还是磷酸化?

A:由于大部分药物是在膜上和胞浆内都起作用,主要是影响信号通路活性,所以一般情况下先检测磷酸化水平可能会更好,信号通路磷酸化抗体芯片可以对单/多条信号通路进行综合评价,在省时省力的同时提高了数据的完整度和科学性,帮您在最短的时间内定位到您关注的实验现象中受到扰动的关键信号通路和通路中的信号分子。如果您确定药物是直接入核,调节相关基因表达,您也可以先检测蛋白差异变化,可以采用蛋白表达筛选芯片和iTRAQ质谱技术。

15. Q:蛋白芯片如何应用于肿瘤研究?

A:很多研究人员在研究过程中发现其研究的肿瘤中,多条信号通路都可能发生改变,针对这种情况需要用广谱的抗体芯片/蛋白芯片进行多信号通路筛选。推荐肿瘤信号通路广谱筛选抗体芯片CSP100和细胞磷酸化谱筛选抗体芯片PEX100。

16. Q: 客户该如何选择蛋白芯片产品?

A: 如果您的检测目标在一些功能比较聚焦的蛋白芯片上,您可以有针对的选择相关蛋白芯片产品,而不一定只追求高通量。如果您的实验还处于起步阶段,想通过蛋白芯片找到合适的蛋白类型,则可能需要进行大规模的高通量蛋白芯片筛选实验。另外,如果实验材料为细胞,由于样本组别较少则选择固相芯片比较合适。如果实验材料为临床或动物样本,可以选择液相悬浮抗体芯片/蛋白芯片进行相对高通量的多样本检测。

17. Q: 蛋白芯片是否可以用于临床诊断?蛋白芯片检测结果是不是可以直接发文章?

A: 目前蛋白芯片主要用于临床前期的科学研究,一旦相关实验结果得到认可,在形成具体产品以后可以投入临床运用,但需要有行政批文。由上海数康生物科技有限公司研发的应用于临床检测的肿瘤标志物蛋白芯片(C-12)即是较好的蛋白芯片已经在临床开展应用,是未来蛋白芯片技术进入临床领域的典型应用案例。目前应用蛋白芯片发表的研究类文章已经非常多,从这些文献看来,蛋白芯片一般定位还是蛋白筛选工具。先对少量样品中的大量蛋白质进行差异蛋白质分析,找到目标蛋白质后,再利用传统的Western blot以及ELISA验证更多样品中的目标蛋白表达情况,从而获得可靠数据以证实论文观点。蛋白芯片技术可以极大提高科学研究的效率,更能够获得较为全面的数据,以在研究中得到创新的结果和结论,是科学论文发表的加分项。

18. Q:基于bDNA技术的蛋白磷酸化检测服务Procarta SH2 Domain Plex Kit与FullMoon的磷酸化蛋白芯片在有哪些差别?检测的数量和结果有什么差别? 

A:我们现在液相芯片只做Merck的Milliplex,不做Procarta了。
区别:液相芯片是在不同颜色标记的微珠上包被捕获抗体,捕获抗原后,再用抗原的检测抗体对抗原进行检测,最后通过仪器识别微珠收集抗体信号的强度,进而对抗原的种类和含量进行检测,液相芯片适合做样本数比较多(一块板可以做80个样本,做二重复的话,可以做40个样本),因子数不太多(比如10多个)的项目。固相芯片是直接在玻璃片上分别点了大量蛋白磷酸化抗体和非磷酸化抗体。通过检测样本中抗原与两种抗体结合的比值来看不同样本间的差异。固相芯片因子数较多,但因子不能随意组合,单张芯片只能做一个样本。

19. Q:公司提供Full Moon的Protein Extraction Buffer 或者RIPA Lysis Buffer么? 

A:我们可以提供专用的Protein Extraction Buffer,但裂解后的样品不稳定性增强,建议客户直接送细胞沉淀或组织块,由公司进行蛋白的提取。

20. Q:客户的样本是两个细胞系,如果做FullMoon公司的蛋白磷酸化芯片,客户应如何提供样本,实验周期要多久?

A:做FullMoon公司的蛋白磷酸化芯片,需要收集1×106以上的细胞,用预冷1×PBS洗涤3-5遍后,离心收集细胞沉淀,-80℃冷冻保存即可。
试验周期:从收到样品开始计算,如果芯片有现货,试验周期为3-4周,如果芯片没有现货,试验周期为9-10周。

21. Q:恒河猴线粒体能量代谢相关蛋白芯片有哪些?是否有氧化损伤的蛋白芯片?这些芯片是否可以做人的蛋白?

A:能量代谢相关的芯片,华盈目前只有一款AMPK信号通路蛋白磷酸化芯片(PAM174),或者可以使用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片(PEX100)进行筛选;氧化损伤相关芯片目前还没有,但是信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片(PEX100)可以作为备选,这个芯片包括30个信号通路的432个蛋白的679个磷酸化位点。以上这些芯片是人猴通用的。

22. Q:有客户想咨询蛋白芯片服务,样本类型是大鼠脑组织,检测蛋白磷酸化程度,推荐哪个服务?有什么需要客户提供的信息吗?价格或成本差别大吗?

A:一般可供选择的有xMAP技术和蛋白固相芯片(磷酸化芯片),xMAP项目检测因子数多,一次可以检测80个样本的80种基因或50种因子,所需样本量少,只需要50 ul即可,适合因子数比较多,样本数比较多,样本比较珍贵的项目。蛋白固相芯片是将抗体点在载玻片上,加入样品,进而检测样品中相关因子的水平(包括磷酸化水平),一张芯片只能做一个样品,但一张芯片检测的因子数多,适合单个样本量大,样本数少,检测因子比较多或特定通路的磷酸化状态的项目。需要样品种属,样品类型,检测因子,样品数量,单个样品量等,我们要先根据这些信息查询是否可以检测,然后进行价格和成本核算。

23. Q:Signaling Explore Array(SET100)和Phospho Explorer Array(PEX100)这两款芯片有什么不同?客户应该怎么选择?

A:首先,这两款芯片的抗体数不同,SET100包含1358种抗体,只能检测人的样本,PEX100包含1318种抗体,可检测人,小鼠,大鼠;其次,这两款芯片的目的不同,SET100包含20多种信号通路,目的是通过高通量筛选和发现新的Biomark,它的Target protein按照蛋白家族分类,是为了研究样本处理后影响了哪个蛋白家族的哪个蛋白,进一步通过哪个信号通路来影响表型的,可以精确到蛋白亚型。PEX100的目的也是通过高通量筛选和发现新的Biomark,但这个芯片Target protein是按照蛋白的的磷酸化位点分类,是研究样本处理后影响了哪个蛋白的哪个位点的磷酸化,进而影响了哪条信号通路来影响表型的,可精确到某个蛋白的磷酸化位点。客户可根据需要进行选择。
在选择时应该考虑以下几个方面:
1. 确定研究目的是什么?是研究磷酸化位点?还是研究蛋白亚型?
2. 是否明确要研究的信号通路?不明确要研究的信号通路,一般选用广谱筛选芯片,明确要研究的信号通路,一般选用相应的信号通路芯片,但一定要查看Target protein是否包含要研究的位点,如果不包含,则需要重新考虑研究方案。

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