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表观组-焦磷酸测序

焦磷酸测序介绍

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase) 这4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。它是单个或多个特定甲基化位点定量检测的金标准,是高通量甲基化测序和芯片较为理想的验证方法,另外,焦磷酸测序还可以定性检测SNP。

 

技术原理

  1. 在每一轮测序反应中,待测样本的反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP);
  2. 互补的碱基结合在模板上时,会释放出一个焦磷酸基团Pyrophosphate (PPi);
  3. 在ATP 硫酸化酶的作用下,生成的PPi 可以和APS 结合形成ATP;
  4. 在荧光素酶的催化下,生成的ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光;
  5. 光信号被CCD数码相机捕捉,经过软件处理后,获得一个特异的检测峰;
  6. 反应体系中剩余的dNTP 和残留的少量ATP 在Apyrase 的作用下发生降解;
  7. 待上一轮反应完成后,加入另一种dNTP,使上述反应重复进行。

 

服务流程

  1. 方案确定与专业的引物设计评估
  2. 合同签订与送样
  3. 样本抽提质检
  4. 引物合成与预实验
  5. 亚硫酸盐转化与纯化
  6. PCR扩增与纯化(有一端引物带有生物素标记,扩增出包含测序序列的区域,扩增后用链霉亲和素磁珠纯化。)
  7. 焦磷酸测序
  8. 数据分析

 

样品要求

  1. 浓度>25ng/μl,总量>500ng(起始量根据每个样本要做的反应数可适当调整);
  2. OD260/280=1.6-2.0,OD260/230>1.5;
  3. 电泳主带清晰,无明显降解;
  4. 无蛋白和RNA污染;
  5. 特殊样本,如FFPE等,可以降低条件,但是有风险。

 

仪器平台

  • Qiagen PyroMark Q96 ID实时定量焦磷酸序列分析仪

 

应用案例

焦磷酸测序检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平

研究者利用Illumina Human Methylation27芯片对9例样本(4例正常,5例宫颈癌)进行全基因组启动子区甲基化扫描,结果显示宫颈癌患者UTF1启动子区域呈现出高的甲基化状态。为了验证芯片筛选的结果,采用焦磷酸测序方法首先对这些样本的UTF1启动子区域进行深入分析,结果表明正常宫颈中UTF1启动子区域呈现低甲基化状态,而相同的位点在SCC中呈现高甲基化状态。为了进一步验证,研究者扩大样本量,对47例不同类型的石蜡包埋组织样本及10例白细胞进行焦磷酸测序检测,与之前的结论保持一致。结合RNA水平和蛋白水平的实验,研究者后提出UTF1启动子甲基化状态可以作为宫颈癌诊断的一个重要的分子标志物。

原文:Aberrant Promoter Methylation and Expression of UTF1 during Cervical Carcinogenesi. Plos One. 2012 ,7(8):e42704.


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